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技术 不同乳酸菌剂对发酵全混合日粮霉菌毒素含量的影响

上海市奶牛研究所2018-08-27 15:43:18


摘  要

本试验研究了不同乳酸菌剂对FTMR6种霉菌毒素含量的影响。将不同乳酸菌剂组(无添加组、添加BM组、添加CL组和添加YX组)FTMR贮存发酵64天,采用多功能色谱柱净化-电化学衍生-高效液相色谱法测定FTMR中的黄曲霉毒素,免疫亲和柱-高效液相色谱法测定玉米赤霉烯酮和呕吐毒素含量,外标法定量。结果表明,4个处理组AFB1含量分别为23.37 μg/kg19.71 μg/kg21.81 μg/kg20.39 μg/kgZEN含量分别为1159.95 μg/kg665.71 μg/kg964.12 μg/kg851.74 μg/kgDON含量分别为140.34 μg/kg117.46 μg/kg130.89 μg/kg130.09 μg/kg4组中均未检测出AFG1AFB2AFG2。以上结果说明,乳酸菌剂能够显著降低FTMR中霉菌毒素含量,其中以BM乳酸菌剂效果最好。


关键词

乳酸菌剂;发酵全混合日粮;霉菌毒素


霉菌毒素(Mycotoxins)是由霉菌产生的有毒代谢产物,霉菌及霉菌毒素的污染极大的影响农作物产量,降低饲料及畜产品品质,甚至严重威胁人类的健康和生命安全。据估计,世界上有300种霉菌毒素对人类和动物有毒,目前已知的有200多种,其中,曲霉菌(Aspegillus)、镰刀菌属(Fusarium)和青霉菌属(Penicillium)是产生毒素最主要的霉菌。


物理和化学方法是消除霉菌毒素的常用方法,但两者均不能彻底根除毒素,而且还不可避免的残留有害物质,而生物学方法因具有安全、无污染、高效等特点而越来越受到关注。乳酸菌作为食品级安全菌株,长期应用于发酵食品及饲料的生产和保存中,是重要的生物防腐剂。一直以来,关于乳酸菌抑制细菌活性的报道较多,近年来,也有研究证明乳酸菌具有抑制霉菌活性的作用。


目前,检测饲料及食品中霉菌毒素的方法很多,主要有薄层色谱法、酶联免疫吸附法、电化学衍生-高效液相色谱法、免疫亲和柱净化荧光光度法和免疫亲和柱高效液相色谱法、多功能柱色谱净化高效液相色谱法等。高效液相色谱法具有准确度高、灵敏度强、检测限低等优点,是目前最常用的用于检测饲料中毒素的方法。本研究是向发酵全混合日粮(Fermented MixedTotal Ration, FTMR)中添加不同乳酸菌剂,采用多功能色谱柱净化(MFC-电化学衍生-高效液相色谱法(HPLC)测定FTMR中的黄曲霉毒素(Aflatoxin, AFT),利用免疫亲和柱-高效液相色谱法(IAC-HLPC)测定FTMR中的玉米赤霉烯酮(Zearelenone, ZEN)和呕吐毒素(Deoxynivalenol, DON),来探讨乳酸菌剂对6种霉菌毒素含量的影响,以期找到有效的抑制FTMR中霉菌毒素的乳酸菌剂。


01
材料与方法


1.1 试验材料


主要材料为FTMR:精粗比为64,含水量为48 %的日粮,营养成分见表1

主要试剂为AFT标准品(纯度≥99 %):由美国 Romer Labs 生产。ZEN标准品(纯度≥99 %):由美国 Romer Labs 生产。DON标准品(纯度≥99 %):由美国 Romer Labs 生产。乙腈:色谱纯。甲醇:色谱纯。叠氮化钠:分析纯。硝酸:分析纯。溴化钾:分析纯。吐温-20:分析纯。去离子水:经过0.45 μm水相滤膜。    

 

乳酸菌剂(Lactic Acid Bacteria Inoculants, LAB Inoculants):饲料级,市面上购买,分别为BM乳酸菌剂,主要成分为多种天然乳酸菌,粉末状,活菌数2×1010 cfu/g,由美国BM公司生产;CL乳酸菌剂,主要成分多种天然乳酸菌,粉末状,活菌数1×1010 cfu/g,由加拿大CL公司生产; YX乳酸菌剂,主要成分为多种天然乳酸菌,粉末状,活菌数1×1011 cfu/g,由台湾YX公司生产。

主要仪器为TMR搅拌车:上海正宏农牧机械设备有限公司立式固定式TMR饲料搅拌车,中国上海。真空泵:水环式真空泵,中国崇明。发酵袋:60 cm*100 cm*24丝(双面厚度)聚乙烯塑料袋,中国上海。高效液相色谱仪及配套VWDFLD检测器: HP 1100型,美国Agilent公司。氮吹仪:N-EVAPTM 112型,美国Organomation公司。电化学衍生装置:Kobra Cell,荷兰LAMERS公司。AFT固相萃取柱:MycoSep 226 AflaZon + Multifunctional Columns, 由美国Romer Labs 生产。ZEN固相萃取柱:ZearaStar Immune Affinity Columns,由美国Romer Labs 生产。DON固相萃取柱:DONStarTMR IAC Column,由美国Romer Labs 生产。


表1 FTMR日粮组成及营养水平


1.2  试验设计
1)每千克预混料包含The premix per kg containVA 7780 IU; VD 1873IU; VE 91225 IU; Fe 9.0 g; Zn (ZnSO4) 6.5 g; Mn 7 g; I 0.08 g; Se 0.04 g; Cu1.5 g; Co 0.06 g.


试验设置对照组和试验组。对照组(无添加组)是精粗比为64,含水量为48 %TMR日粮。奶牛营养需要参照NRC和《中国奶牛饲养标准》。试验组是在对照组日粮基础上,分别根据乳酸菌剂推荐量添加0.001 %BM乳酸菌剂、0.001 %CL乳酸菌剂和0.002 %YX乳酸菌剂的TMR日粮。采集贮存第64天的FTMR,用提取液提取试样中的AFT采用多功能柱净化-电化学衍生-高效液相色谱法检测,ZENDON采用免疫亲和柱净化-高效液相色谱法检测,外标法定量。


1.3 FTMR制作工艺


试验于20111月至5月(该时间的气温在-2 ~27.5 ℃之间)在上海市奶牛研究所实验牧场进行,生产FTMR的精料和粗料由上海牛奶集团鼎牛饲料有限公司提供。按照配方要求,将羊草、苜蓿、青贮玉米和精料等各种原料以先粗后细,先轻后重的原则分别添加到TMR搅拌车中,所有的原料添加完毕后,再添加适量水继续搅拌,将其调制成含水量为48 %TMR。将制作好的TMR料装入发酵袋内,每袋净重6.60±0.78 kg,用真空泵抽出袋内空气,扎紧密封,外面再套上一层发酵袋,防止漏气,制成FTMR。袋子外面贴上标签(标签上注明:名称、重量、编号、制作时间、制作人等内容),将制作好的FTMR存放在室内干燥地面上。


1.4 液相色谱工作条件


1.4.1  AFT测定液相色谱工作条件


色谱柱为ZORBAX SB-Aq C18柱(4.6 mm×100 mm, 5μm);流动相为水甲醇乙腈溶液(5/1/1V/V/V);流速为2.00 mL/min;进样量为100.0 μL;柱温为30 ℃;荧光检测器(fluorophotometric detector,FD)激发波长(Ex):235 nm,发射波长(Em):460 nm;检测时间为21.50 minKobra Cell工作电流:100 μA


1.4.2  ZEN测定液相色谱工作条件


色谱柱为Thermo SCIENTIFEC ODS HYPERSIL C18柱(2.1 mm×100 mm, 5μm);流动相A为水,B为乙腈水溶液(36/64V/V),时间设定见表2;流速为0.5000 mL/min;进样量为50.0 μL;柱温为30 ℃;荧光检测器激发波长(Ex):235 nm,发射波长(Em):460 nm;检测时间为15.00 min

表2 流动相时间设定



1.4.3 DON测定液相色谱工作条件

 

色谱柱为 Thermo SCIENTIFEC(赛默飞世尔科技)生产的 ODS HYPERSIL  C18柱(2.1 mm×100 mm, 5 μm);流动相A为每1000 mL-甲醇-乙腈(96/2/2V/V/V)溶液中入5 mg叠氮化钠(NaN3)制成,B为乙腈,时间设定见表3;流速为0.5000 mL/min;进样量为50.0 μL;柱温为30 ℃;紫外检测器(ultraviolet detector, UVD)波长为220 nm;检测时间为17 min

表3 流动相时间设定



1.5  标准溶液配制、标准曲线制作及回归方程的计算


1.5.1  AFT标准溶液配制、标准曲线制作及回归方程的计算


AFT标准工作液制备:用乙腈水溶液(21/114, V/V)AFT标准液(B1: 2.00 μg/ml, G1: 2.00 μg/ml, B2: 0.5 μg/ml, G2: 0.5 μg/ml)稀释20倍,然后将稀释后的溶液用乙腈水溶液(21/114, V/V)配制成AFB1AFG1的系列标准溶液:50 μg/kg20 μg/kg10 μg/kg5 μg/kg2 μg/kgAFB2AFG2的系列标准工作液12.5 μg/kg5μ g/kg2.5 μg/kg1.25 μg/kg0.5 μg/kg


在上述色谱条件下进样分析,以HPLC测得的峰面积为纵坐标(y),以混合标准工作液中B1B2G1G2的浓度为横坐标(x)绘制标准曲线,得出AFT B1B2G1G2的线性回归方程、相关系数和线性范围,根据3倍信噪比计算出检测限。


1.5.2  ZEN标准溶液配制、标准曲线制作及回归方程的计算


ZEN标准工作液制备:用乙腈溶液将ZEN标准品(100 μg/ml)稀释10倍,然后再将稀释后的溶液用流动相配制成5000 μg/kg2500 μg/kg1000 μg/kg500 μg/kg200 μg/kg50 μg/kg的系列标准工作液。


在上述色谱条件下进样分析,以HPLC测得的峰面积为纵坐标(y),以标准工作液中ZEN的浓度为横坐标(x)绘制标准曲线,得出ZEN的线性回归方程、相关系数和线性范围,根据3倍信噪比计算出检测限。


1.5.3  DON标准溶液配制、标准曲线制作及回归方程的计算


DON标准工作液制备:用乙腈溶液将DON标准液(100 μg/ml)稀释10倍,然后再将稀释后的溶液用流动相(不加NaN3)配制成5000 μg/kg2500 μg/kg1000 μg/kg500 μg/kg200 μg/kg50 μg/kg的系列标准工作液。


在上述色谱条件下进样分析,以HPLC测得的峰面积为纵坐标(y),以标准工作液中DON的浓度为横坐标(x)绘制标准曲线,得出DON的线性回归方程、相关系数和线性范围,根据3倍信噪比计算出检测限。


1.6 方法回收率和精密度试验


对空白样品进行三个水平的样品加标(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、ZEN、DON)回收率试验和方法精密度试验,其中B1和G1分别添加2.50、10.00、20.00 μg/kg,B2和G2分别添加0.75、3.00、6.00 μg/kg,ZEN添加500、1000、5000 μg/kg,DON添加500、1000、5000 μg/kg,每个水平设3个重复。


1.7 测定指标及方法


1.7.1  测定指标


不同乳酸菌剂FTMR各处理组中AFB1AFG1AFB2AFG2ZENDON含量。


1.7.2  采样方法


FTMR贮存发酵至64天时,开袋采集15 kg样品,充分混合均匀,四分法缩分至500 g,带回实验室,用于霉菌毒素检测。


1.7.3  测定方法


1.7.3.1  AFT测定方法


准确称取25.0 g剪短的FTMR试样,置于250 mL锥形瓶中,加入100 mL乙腈水溶液(84/16, V/V),在水平震荡器上水平匀速震荡1 h240 rpm),静置,过滤。吸取约6 mL滤液加入AFT固相萃取柱试管中,将多功能柱套入试管内,缓慢将套管推至试管底部,使提取液以2.5 mL/min[10]的速度进入套管中,取100 μL萃取溶液与440 μL去离子水混合,震荡。上机检测,外标法定量。


1.7.3.2  ZEN测定方法


    准确称取25.0 g剪短的FTMR试样,置于250 mL锥形瓶中,加入100 mL乙腈水溶液(84/16V/V),在水平震荡器上水平匀速震荡1 h240 rpm),静置,过滤。将13 mL PBS溶液加入2 mL滤液中,摇匀。将ZEN固相萃取柱连接到多头固相萃取仪上,将上述15 mL溶液加入萃取柱中,使其以1/s的速度低下(下同),直至空气进入柱子。将10 mL 0.1 %吐温-20溶液加入固相萃取柱,直至空气进入柱子。将10 mL去离子水加入萃取柱,直至空气进入柱子,用洗耳球吹干萃取柱。用3 mL甲醇溶液洗脱,洗脱液收集于特制试管中,直至空气进入柱子,将上述洗脱液在常温下用氮气吹干。向特制试管中加入200 μL流动相,震荡溶解,高速离心5 min10000 rpm)。取上清液上机检测,外标法定量。


1.7.3.3  DON测定方法


准确称取25.0 g 剪短的FTMR试样,置于250 mL锥形瓶中,加入100 mL去离子水,在水平震荡器上水平匀速震荡1 h240 rpm),静置,过滤。将免疫亲和柱封盖取下,将其下端连接到多头固相萃取仪上,抽取免疫亲和柱中的保存液,取滤液1 mL放入免疫亲和柱净化,使其以1/s的速度滴下(下同),直至空气进入柱子;再取5 mL PBS溶液放入亲和柱,过滤,直至空气进入柱子,以上弃去滤液。最后取1.5 mL甲醇溶液洗脱,洗脱液收集于特制试管中,直至空气进入柱子,将上述洗脱液在常温下用氮气吹干。向特制试管中加入300μL流动相,震荡溶解,高速离心5 min10000 rpm)。取上清液经过电化学在线柱后衍生,上机检测,外标法定量。


1.8 数据统计分析


所有数据均采用EXCEL 2003进行初步数据处理,然后用SPSS 19.0中的LSD程序过程进行方差分析和Duncan法多重比较,显著水平设定为P<0.05


02
结果


2.1 线性范围及检测限


AFB1AFG1在质量浓度为2~50 μg/kg的范围内质量浓度与其峰面积有良好的线性关系,相关系数为0.9996,检出限为1.0 μg/kgAFB2AFG2在质量浓度为0.5~12.5 μg/kg的范围内质量浓度与其峰面积有良好的线性关系,相关系数为0.9997,检出限为0.3 μg/kgZEN在质量浓度为50~5000 μg/kg范围内质量浓度与其峰面积有良好的线性关系,相关系数为0.9996,检出限为32.0 μg/kgDON在质量浓度为50~5000 μg/kg范围内质量浓度与其峰面积有良好的线性关系,相关系数为0.9999,检出限为50.0 μg/kg


2.2 方法的回收率及精密度试验


AFB1的平均回收率为81.0 %~95.3 %,RSD为2.3 %~6.2 %。AFB2的平均回收率为76.7 %~85.8 %,RSD为5.2 %~6.5 %。AFG1的平均回收率为79.5 %~81.0 %,RSD为2.0 %~2.7 %。AFG2的平均回收率为76.6 %~88.3 %,RSD为3.2 %~4.6 %。ZEN的平均回收率为86.6 %~90.9 %,RSD为2.5 %~5.4 %。DON的平均回收率为88.0 %~94.7 %,RSD为2.5 %~4.0 %。


2.3 FTMR霉菌毒素检测结果


不同乳酸菌剂FTMRAFTZENDON含量的影响结果见表4。由表4可知,不同乳酸菌FTMR中,黄曲霉毒素B1的含量分别为23.37 μg/kg19.71 μg/kg21.81 μg/kg20.39 μg/kg,添加乳酸菌剂可以降低FTMRAFB1含量,但差异不显著(P>0.05)。三个添加组中,添加BMAFB1含量最低(P>0.05)。各处理组中均为检测出AFG1AFB2AFG2。各处理组的ZEN含量分别为1159.95 μg/kg665.71 μg/kg964.12 μg/kg851.74 μg/kg,添加乳酸菌可以显著降低FTMRZEN含量(P<0.05),3个乳酸菌剂添加组中,以添加BMZEN含量为最低(P<0.05)。各处理组DON含量分别为137.84 μg/kg114.46 μg/kg129.71 μg/kg129.39 μg/kg,添加BM乳酸菌剂显著降低了FTMRDON含量,而添加CL组和添加YX组降低不显著(P>0.05)。




03
讨论


霉菌同其它微生物之间的相互竞争作用是自然界非常普遍的现象,这种作用会导致营养竞争,从而影响霉菌生长和毒素的产生,另外,乳酸菌还可以通过细胞壁成分与霉菌毒素结合,从而清除毒素。曹冬梅等通过厌氧培养法对具有霉菌抑制活性的乳酸杆菌和黄曲霉共培养以研究抑制效果发现,该乳酸菌能显著抑制黄曲霉生产及AFB1的产生,国内外很多研究都证明了这一点。本研究结果表明,乳酸菌降低了FTMRAFB1的含量(P>0.05),其中以BM乳酸菌剂效果最好。这是由于乳酸菌在一定条件下可以降解黄曲霉毒素,从而达到脱毒作用


本研究中,不同乳酸菌剂FTMR各处理组中,各处理组ZEN含量均达到轻度污染,但从检测结果可以看出乳酸菌剂极显著(P<0.01)降低了ZEN含量,其中以BM乳酸菌剂效果最好。El-Nezami研究了乳酸杆菌结合镰刀菌产生玉米赤霉烯酮及其衍生物的情况,结果表明,该种乳酸菌具有从食品和饲料中消除ZEN的能力,程波财也得出同样的结论。


不同乳酸菌剂FTMR各处理组中DON含量均没有超过我国规定的泌乳动物配合饲料限量标准的1000 μg/kg,属于轻度污染。程波财为寻找去除DON的益生菌,通过培养,筛查出了多株对DON具有降解作用的乳酸菌,其中枯草芽孢杆菌ZZ和地衣芽孢杆菌DYDON的降解力高达98%72.2%。本研究结果表明,3种乳酸菌剂降低了FTMRDON含量,其中BM乳酸菌剂显著(P<0.05)降低了DON含量效果最好,原因可能是某些乳酸菌产生的细菌素杀灭或抑制了镰刀菌,从而使该菌代谢产物DON含量降低。


04
总结


本试验条件下,三种乳酸菌剂对霉菌毒素均具有较好的降低作用,其中以BM乳酸菌剂效果最好。

(作者:崔彦召,黄克和,张克春。参考文献略)